PAX6 es un factor de transcripción implicado en el desarrollo ocular cuya haploinsuficiencia está asociada con la aniridia congénita. Aproximadamente el 15% de las mutaciones en PAX6 afectan a los sitios canónicos del splicing. Generalmente, las variantes espliceogénicas resultan en el skipping de exón, pero también pueden potenciar el uso de sitios crípticos. El objetivo de este trabajo fue estudiar los efectos sobre el splicing de variantes ubicadas en los aceptores canónicos de PAX6.

A partir de nuestra cohorte de pacientes con aniridia o de bases de datos mutacionales, se seleccionaron variantes intrónicas cercanas al aceptor canónico, es decir, localizadas entre los nucleótidos -1 y -9 de cualquier exón de PAX6. Se estudiaron in vitro aquellas variantes potencialmente espliceogénicas tras el análisis in silico. Para ello, se generaron tres minigenes multiexónicos que contenían la región genómica completa de PAX6 entre los exones 5-7, 8-11 y 10-13, respectivamente. Las variantes se introdujeron mediante mutagénesis dirigida. Tras transfectar células HEK293 con los constructos wild-type y mutados, se analizó el patrón de splicing mediante RT-PCR realizando secuenciación de lecturas largas en un dispositivo MiNION (Oxford Nanopore Technologies). La detección y cuantificación de isoformas transcripcionales se realizó con el software VIsoQLR.

Finalmente, diez variantes próximas a sitios aceptores mostraron potencial efecto sobre el splicing y fueron analizadas in vitro. De ellas, cuatro produjeron el skipping del exón afectado y las seis restantes condujeron a la activación de otros aceptores crípticos exónicos o intrónicos, causando pequeñas deleciones exónicas o retenciones intrónicas, respectivamente.

Las variantes localizadas en regiones canónicas de diferentes exones pueden afectar al splicing de forma diferente a pesar de encontrarse en el mismo gen. El análisis in vitro con minigenes permite comprobar la implicación en el proceso de splicing de variantes de significado incierto en PAX6.