La incorporación de la NGS en los servicios de Genética Médica ha generado un aumento en la tasa diagnóstica de patologías de base genética, en especial, Enfermedades Raras (ER). Sin embargo, el estudio de las mutaciones en el ADN, ofrece limitaciones, siendo necesario introducir y sistematizar la información aportada por otras técnicas ómicas, como RNA-Seq.

Para ello, se ha desarrollado una pipeline bioinformática (Rdiag-seq) que caracteriza eventos de splicing aberrantes (ESAs) en muestras secuenciadas con RNA-Seq, dentro de una región diana específica y cuyas variantes son conocidas. A su vez, se ha realizado una validación (benchmarking) en un conjunto de muestras con alteraciones confirmadas con RT-PCR.

Rdiag-seq se ha desarrollado en python >=3.9 y en R >=4.0.0. Se ha utilizado para el benchmarking el conjunto de muestras de Cummings et al. 2017 de pacientes afectados con patologías neuromusculares que forman un conjunto de ESAs de referencia.

La pipeline: 1)incorpora diferentes programas de contaje de uniones exon-exon, 2)establece esquemas de ESAs a partir de las uniones exon-exon determinados como ‘outliers’ 3)proporciona criterios para el filtrado de los ESAs potencialmente deletéreos.

Se han validado las herramientas FRASER y LeafcutterMD en 3 contajes diferentes. Las sensibilidades obtenidas respecto al total de uniones exón-exón, alcanzan un máximo del 80% en el caso de LeafcutterMD y del 95% en FRASER. LeafcutterMD determina al menos 1 unión exon-exón en el 90% de los eventos y FRASER identifica el 100%.

Sin embargo, el número de outliers determinados en LeafcutterMD es superior a FRASER  siendo el porcentaje de solape del 17% y del 26% respectivamente, lo que sugiere una presencia alta de artefactos, especialmente en LeafcutterMD.

A su vez, se han podido establecer nuevos ESAs candidatos en las muestras de validación.

Se ha demostrado la viabilidad de aplicar RNA-Seq para la mejora del estudio de pacientes con ER.